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肠 S9 温孵法研究川芎多成分肠吸收过程中的肠壁

[摘要]生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system,BCS)研究中,肠吸收性评价实验要考虑吸收过程中的肠壁代谢问题,因此该研究选用大鼠肠S9对川芎中多成分的肠壁代谢进行研究,为进一步BCS肠吸收性评价实验厘清代谢影响。利用大鼠肠S9对川芎水提液进行体外温孵实验研究,通过HPLC指纹图谱技术,对比研究多成分色谱峰面积温孵前后的变化。结果表明川芎水提液经肠S9温孵后,以指纹图谱表征的多成分谱图中,洋川芎内酯I等多个成分发生肠壁代谢,有1个代谢转化成分生成。阿魏酸等多个成分不发生肠壁代谢。因此,建议下一步川芎的BCS肠吸收性评价实验可以对不发生肠壁代谢成分直接测定,而对肠壁代谢成分的肠吸收性评价则需要探索更合适的实验方法。
 
  [关键词]生物药剂学分类系统;肠S9;多成分
 
  生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classifi-cation system,BCS)于1995年被Gordon L.Amidon教授等[1]首次提出,渗透性是其中的重要指标之一。研究药物渗透性的方法有外翻肠囊法、在体单向肠灌流法、肠灌流并行采血法等[2]。文献[3]报道,由于肠壁代谢的影响,对药物的渗透系数测定时需要根据待测药物的肠壁代谢情况选用合适的实验方法。中药成分众多且复杂,为坚持中药多成分整体性研究的原则,充分利用化学指纹图谱技术的特点,开展多成分肠壁代谢同时研究是可行的。肠壁代谢实验方法有很多,通过前期实验方法的研究,肠S9代谢研究法因肠S9制备相对简单,方法成熟[4-5],反应时间短,可直接、快速反映肠壁代谢行为的优点而被选中。川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎,始载于《神农本草经》。目前对川芎的研究多集中在单一成分的代谢[6-8],对其整体多成分的代谢也有报道[9],但是采用体外法研究川芎中多成分的肠壁代谢却未见文献报道。
 
  因此,本研究对川芎水提物进行研究,应用大鼠肠S9代谢研究法,结合多成分指纹图谱分析,探索肠S9对川芎中多成分的代谢情况,从而为下一步川芎中多成分肠渗透性定性和定量分析提供基础支撑和指导。
 
  1材料
 
  WATERS 600液相色谱系统(Milford,MA,USA),由Delta600四元泵和2487双波长紫外检测器组成,工作站为Millennium 32。1-15PK离心机(德国Sigma公司)。
 
  川芎饮片购买于北京同仁堂药店,经北京中医药大学王晶娟副教授鉴定其来源为伞形科藁本属植物川芎L.Chuanxiong的干燥根茎;阿魏酸对照品(Aladdin,纯度99%,批号F111083-5g);洋川芎内酯I(成都普菲德生物技术有限公司,纯度≥98%,批号141027);甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);纯净水(娃哈哈);其他试剂均为分析纯。
 
  SD大鼠,雄性,体重280~320 g,北京斯贝福实验动物科技有限公司提供,许可证号SCXK(京)2011-0004,动物饲养于北京中医药大学实验动物部标准屏障环境内,自由饮食,明暗节律12 h/12 h。
 
  2方法
 
  2.1溶液配制
 
  2.1.1川芎水提液制备取川芎饮片100.51 g,加1 L去离子水回流提取1.5 h,趁热过滤,滤渣加1 L去离子水再次提取,趁热过滤。合并滤液并浓缩,定容到100 mL量瓶中,备用,试验时稀释到所需浓度。
 
  2.1.2对照品溶液配制分别精密称取阿魏酸、洋川芎内酯I对照品于10 mL量瓶中,甲醇溶解稀释为质量浓度约为0.2 g·L-1的对照品溶液。
 
  2.1.3 KCl溶液配制准确称取15.4 mmol·L-1KCl,加去离子水100 mL溶解制成1.15%的KCl溶液,放置备用。
 
  2.1.4 20 mmol·L-1 HEPES缓冲液配制取20 mmol·L-1 HEPES,15.4 mmol·L-1 KCl置100 mL量瓶中,加蒸馏水至刻度线附近,再用1 mol·L-1 NaOH调节pH至7.41,即得。
 
  2.2肠S9制备
 
  大鼠禁食过夜(自由饮水),水合氯醛麻醉后,打开腹腔,用冰冷(0~4℃)的1.15%KCl冲洗至无内容物流出,取小肠,剪成小段,放入冰冷的1.15%KCl溶液中。剪开小肠,将小肠置于冰冷的玻璃板上,用玻璃片刮取小肠黏膜,加入冰冷的3倍量含有1.15%KCl的HEPES缓冲液(pH 7.4),冰浴中匀浆。匀浆于4℃,9 000×g离心20 min,得上清液为S9。分装于离心管中,Bradford法测蛋白含量,-80℃保存。
 
  2.3蛋白沉淀剂选择
 
  为了选取适当的蛋白沉淀试剂,对常用的沉淀蛋白的试剂甲醇、乙腈、高氯酸进行比较分析,择优选取蛋白沉淀试。
 
  2.4温孵条件
 
  2.4.1对照组取0.5 mL经高温灭活的S9于37℃水浴中预热,再精密吸取0.5 g·mL-1的川芎提取液0.5 mL,37℃温孵30 min,加入0.2 mL高氯酸终止反应,于4℃,1 500×g离心5 min,取上清液20μL进行HPLC分析(n=3)。
 
  2.4.2实验组取0.5 mL S9于37℃水浴中预热,再精密吸取0.5 g·mL-1的川芎提取液0.5 mL,37℃温孵30 min,加入0.2 mL高氯酸终止反应,于4℃,1 500×g离心5 min,取上清液20μL进行HPLC分析(n=3)。
 
  2.5色谱条件[9]
 
  采用Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),检测波长280 nm,流速1 mL·min-1,柱温30℃,进样量20μL,流动相0.1%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0~30 min,2%~34%B;30~35 min,34%~65%B;35~50 min,65%~100%B)。
 
  3结果
 
  3.1 Bradford法测蛋白含量
 
  Bradford法测蛋白时以吸光度A为纵坐标,待测样品中的蛋白含量为横坐标,测定的标准曲线为Y=0.005 5X-0.007 9,相关系数R2=0.996 3。测得制备的肠S9样品中蛋白质量浓度为2.2 g·L-1。
 
  3.2沉淀蛋白试剂考察
 
  对常用的沉淀蛋白的试剂甲醇、乙腈、高氯酸进行比较分析,研究其对川芎水提液的影响,见图1。分析图1中色谱峰的个数可知,沉淀剂对提取液影响最小的是高氯酸,其次是甲醇,最后是乙腈。
  为了进一步考察加入肠S9之后制备样品时沉淀剂对样品的影响,参考上述结果,选取甲醇和高氯酸,分别考察其对样品的沉淀效果,见图2。当针对样品时,两者都会对样品前10 min中的峰造成干扰,甲醇沉淀时主要表现为样品峰形变差,高氯酸表现为杂峰多。综合比较,选取高氯酸为蛋白沉淀剂。
 
  3.3肠S9对川芎中多成分的代谢情况
 
  以原药指纹图谱中表征的19个峰为分析对象,不同处理组的结果见图3。其中峰13,16经对照品指认分别为阿魏酸和洋川芎内酯I。各处理组样品的峰面积见表1。为评价酶对成分代谢的影响效果,引入抑制率的概念和计算公式,代谢率=(对照组峰面积-实验组峰面积)/对照组峰面积×100%,负值表示温孵后峰面积增加,正值表示温孵后峰面积减少。采用统计软件SPSS Statistics 17.0对实验数据进行独立样本t检验,P<0.05为有统计学意义。

  结果显示,与实验组相比,峰1~6,9~14,16,17与对照组有显著性差异(P<0.01),说明温孵前后其峰面积有明显增加或者减少。结合代谢率数值分析可知,峰1,2,9,11,14,16,17温孵后峰面积明显减少,说明其能被肠S9代谢,而峰3~6,10,12温孵后峰面积显著增加,说明肠S9温孵时,有成分间的相互转化。另外,实验组在29.21 min时出现了1个新峰N1,表明其为川芎中多成分经过肠S9代谢后生成的产物,具体物质仍需试验检测。
 
  4结论
 
  对单一成分的肠渗透性评估时,大鼠在体单向肠灌流法是目前应用广泛,且与体内实际情况最为相符的考察药物吸收的方法,其实验的条件与口服给药后的肠道生理环境接近,与人体的相关性良好。夏敬胜等[10]也采用此方法研究葛根和川芎药对的指标成分的肠吸收。但是,由于肠壁对药物的代谢,相对在体单向灌流是基于肠腔内药物的减少量来计算吸收的量,肠灌流并行采血法更能真实的反应药物的吸收情况。本课题组前期在对葛根素进行BCS分类时也证实了这一现象,并建议对此类成分可采用肠灌流并行采血法模型评估其渗透性,然后根据其他的BCS如BDDCS(biopharmaceutics drug dispo-sition classification system)[11]进行分类。
  基于中药的多成分特点,本课题组提出了中药生物药剂学分类系统[12](biopharmaceutics classifica-tion system of Chinese materia medica,CMMBCS)的科学框架。如果要将BCS引入中药多成分体系中,对能被肠壁代谢的成分也不可避免的要对渗透性进行测定,而多成分复杂且微量的特点不可能对每一个成分进行体内外实验。而肠S9是一种用于研究肠对药物代谢的有效可行的方法[13],其制备相对简单,成本低,方便快捷,适合用于初步探索复杂多成分的肠代谢过程。同时本研究的结果与采用体内法研究肠道对川芎多成分的处置结果是一致的[9],证实了实验方法的可靠性。因此利用体外肠S9代谢研究法,将药材中多成分进行筛选分类,其中不被肠壁代谢的成分可采用在体单向肠灌流法测定其渗透性,然后进行BCS归属;而对能被肠壁代谢的成分,借鉴BDDCS,探索适合评估其渗透性的实验方法,对其进行BCS归属确定,这为下一步川芎中多成分肠渗透性定性和定量分析提供了基础支撑和指导。
 
  [参考文献]
 
  [1]Amidon G L,Lennern?s H,Shah V P,et al.A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification:the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability[J].PharmRes,1995,12(3):413.
 
  [2]Li H,Dong L,Liu Y,et al.Comparison of two approaches of in-testinal absorption by puerarin[J].J Pharmacol Toxicol Meth-ods,2014,70(1):6.
 
  [3]Li H,Dong L,Liu Y,et al.Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats[J].Int J Pharm,2014,466(1):133.
 
  [4]Nakamura M,Kawakita Y,Yasuhara A,et al.In vitro and in vivo evaluation of the metabolism and bioavailability of ester pro-drugs of MGS0039(3-(3,4-dichlorobenzyloxy)-2-amino-6-flu-orobicyclo[3.1.0]hexane-2,6-dicarboxylic Acid),a potentmetabotropic glutamate receptor antagonist[J].Drug Metab Dis-pos,2006,34(3):369.
 
  [5]Masaki K,Hashimoto M,Imai T.Intestinal first-pass metabolismvia carboxylesterase in rat jejunum and ileum[J].Drug Metab Dispos,2007,35(7):1089.
 
  [6]Li W,Guo J,Tang Y,et al.Pharmacokinetic comparison of fer-ulic acid in normal and blood deficiency rats after oral administra-tion of Angelica sinensis,Ligusticum chuanxiong and their combi-nation[J].Int J Mol Sci,2012,13(3):3583.
 
  [7]YanR,Ko N L,Li S L,et al.Pharmacokinetics and metabolism of ligustilide,a major bioactive component inRhizoma Chuanx-iong,in the rat[J].Drug Metab Dispos,2008,36(2):400.
 
  [8]YanR,Lin G,Ko N L,et al.Low oral bioavailability and phar-macokinetics of senkyunolide A,a major bioactive component inRhizoma Chuanxiong,in the rat[J].Ther Drug Monit,2007,29(1):49.
 
  [9]刘洋,石任兵,刘斌,等.口服川芎饮片煎液大鼠体液化学成分变化研究[J].北京中医药大学学报,2008,31(5):334.
 
  [10]夏敬胜,蔡瑜.葛根川芎药对中葛根素和阿魏酸的大鼠在体肠吸收机制[J].医药导报,2015,34(2):173.
 
  [11]Wu C Y,Benet L Z.Predicting drug disposition via application of BCS:transport/absorption/elimination interplay and develop-ment of a biopharmaceutics drug disposition classification system[J].PharmRes,2005,22(1):11.
 
  [12]刘洋,隗丽,董玲,等.多成分体系下中药生物药剂学分类系统的构建分析[J].中国中药杂志,2014,39(23):4479.
 
  [13]Kajbaf M,RicciR,Zambon S,et al.Contribution of rat intesti-nal metabolism to the xenobiotics clearance[J].Eur J Drug Metab Pharmacokinet,2013,38(1):33.

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